?純化工藝通常分為澄清、捕獲和精細純化階段——但是隨著細胞培養密度的不斷提高，導致Protein A柱下游產品洗脫液中HCP和DNA含量的增加，此外，病毒滅活后的濁度上升都成為了精細純化階段面臨的嚴峻挑戰。針對這些問題，本文介紹一種能夠解決Protein A柱純化效率的整體性方法，即采用新型復合澄清膜用于純化工藝中的澄清階段。

全球單抗市場銷售額在2017年超過1000億美元，2011～2017年的復合增長率為11.5%。今后為維持這一快速增長勢頭，生物制藥行業從研發到商業化生產需要新一代的單抗生產工藝。隨著細胞培養基及其表達工程體系的不斷發展，目標產品表達量已達到15年前的10倍以上，對于一些難度較高的產品其表達量也取得了很大進展，純化工藝則繼續依賴于傳統的工藝結構。

目前的單抗純化工藝結構大部分如圖1所示：

圖1 傳統的單抗純化工藝

Protein A由于其與抗體Fc片段良好的特異親和性，較高的純化倍數，工藝的簡易性而被用于大多數抗體純化工藝中的捕獲階段。然而，在提高細胞培養密度和延長培養周期從而顯著提高細胞表達量的同時，Protein A柱的純化效率也從產品純度99.9%降至98%～99%。此外，Protein A柱純化的穩定性下降導致精細純化工藝更為繁瑣。目前，因病毒滅活導致料液濁度提高以及Protein A柱產品洗脫液中HCP和DNA含量的增加，使單抗純化工藝需要更為復雜的精細純化步驟和投入更多的成本。

這里我們介紹一種新型的單抗純化方法，它通過顯著加強Protein A柱的效率從而提高單抗純化工藝的性能表現，基本上能使Protein A產品洗脫液立即達到制藥級純度。

3M EmphazeTM AEX復合澄清膜用于澄清階段

關于Protein A柱性能變化的影響機制仍舊是非常熱門的研究話題，細胞發酵液中高濃度的聚集體被認為是干擾Protein A柱純化效果的主要物質，并在純化工藝的各個階段以導致聚集沉淀的媒介形式存在[1,2]。

為減少細胞發酵液中聚集體的含量，我們在澄清階段采用3M EmphazeTM AEX復合澄清膜來替換第二級精細深層過濾器。3M EmphazeTM AEX復合澄清膜是一款全合成產品，由高載量的Q-官能團水凝膠介質和0.2?μm 聚酰胺膜組成，能夠顯著降低細胞發酵液中的可溶性和不溶性雜質。當其用于澄清階段，可將細胞發酵液中DNA含量降低4 logs以上，通量大于400?L/m2。采用3M EmphazeTM AEX復合澄清膜用于澄清階段的純化工藝，及3M EmphazeTM AEX復合澄清膜結構，分別見圖2，3。

圖2 采用3M EmphazeTM AEX復合澄清膜用于澄清階段的純化工藝

圖3 3M EmphazeTM AEX復合澄清膜結構

具有層析機制的澄清解決方案

這里我們考察了將Zeta PlusTM粗級深層過濾（去除細胞）和3M EmphazeTM AEX復合澄清膜相結合應用于澄清工藝階段的性能表現。該產品形式易于放大，適用于從實驗室到生產規模的整個工藝發展流程。圖4總結了該產品組合的澄清效果。從圖中可以看到澄清后的料液濁度持續保持在0.6?FTU。且澄清后料液易通過0.2?μm或0.1?μm過濾器，隨后經Protein A柱純化。由于其獨特的結構設計，3M EmphazeTM AEX復合澄清膜處理料液過程中其壓差幾乎沒有變化，出口料液濁度也維持穩定。

圖4 AEX復合澄清膜對于DNA及HCP去除情況

AEX復合澄清膜也能夠顯著降低細胞發酵液中DNA和HCP的含量。

Protein A柱純化后產品純度

具有層析機制的澄清工藝顯著加強了Protein A柱的捕獲效率，并就HCP和DNA含量上來講，可獲得更高純度的產品。如圖5所示，對比了采用3M EmphazeTM AEX復合澄清膜與僅采用傳統深層過濾器用于澄清工藝對于Protein A洗脫液單抗純度的影響。結果非常明顯，結合具有層析機制的澄清工藝使Protein A柱洗脫液中產品純度就HCP和DNA含量來看可接近或達到注射級標準。

我們對該工藝的平臺化進行測試，結果表明對4種不同單抗產品的純化結果非常相似。

圖5 四種不同單抗的DNA及HCP去除情況

總結

本文介紹了采用3M EmphazeTM AEX復合澄清膜用于澄清工藝的單抗純化新方法。當其替換第二級精細深層過濾器時，細胞發酵液中DNA含量降低量>4 logs，并提高Protein A柱的純化效率，使Protein A洗脫液中產品純度達到或接近注射級標準。

這種工藝改進的結果從根本上加強了工藝性能的表現，包括：

● 重建并簡化下游精細純化工藝；

● 若產品聚集體含量已足夠低的情況下，則可去除精細純化工藝和最終的病毒清除步驟。

該技術以其高穩定性、可放大性和易于實現的特點，作為澄清工藝平臺的應用極大地幫助單抗生產掃清障礙。

【參考文獻】

[1] Gagnon.Emerging Challenges to Protein A

[P].BioProcess International, 2013.

[2] Gagnon et.Nonspecific interactions of chromatin with immunoglobulin G and protein A, and their impact on purification performance [P].Al, Journal of Chromatographic A, 2014.

文/葉璇

本文作者就職于3M中國有限公司。